從一開始就是文化問題。在不知道相關(guān)分子性質(zhì)的情況下，早期的微生物學(xué)家依賴于識別微生物的可遺傳性狀和化學(xué)活動(dòng)，然后通過巧妙的實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行分析。脫氧核糖核酸（DNA）作為遺傳物質(zhì)用來鑒定，以及隨后DNA測序技術(shù)的蓬勃發(fā)展，將微生物學(xué)帶入了基因組時(shí)代�？茖W(xué)家們不僅急于對單個(gè)微生物的基因組進(jìn)行測序，還急于對包含整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中所有微生物DNA的宏基因組進(jìn)行測序。
宏基因組學(xué)和微生物學(xué)研究呈指數(shù)增長。長期以來，生物學(xué)家一直懷疑地球上充斥著比他們所能看到或培養(yǎng)的要多得多的生命形式，現(xiàn)在有了證據(jù)。從人類腸道到海底，復(fù)雜的微生物群落塑造了生命的方方面面。這些新數(shù)據(jù)揭示了誘人的相關(guān)性，將不同的微生物群與從人類腸道健康到氣候變化的一切聯(lián)系起來。現(xiàn)在缺少的是表型：所有這些DNA序列實(shí)際上是做什么的？它們是如何做到的？
現(xiàn)在，研究人員開始利用各種技術(shù)探索這些問題。一些人正試圖分離和培養(yǎng)目前僅從DNA序列所了解到的生物；而另一些人則將宏基因組測序推向新的方向，以對早期所遺漏的病毒、真菌和質(zhì)粒進(jìn)行分類。
創(chuàng)新文化
首批環(huán)境微生物組測序采樣的樣本之一是海洋，結(jié)果顯示了以前從未表征過的大量細(xì)菌。當(dāng)分子生物學(xué)家開始挖掘這些數(shù)據(jù)以了解這些生物體的基本生物化學(xué)組成時(shí)，藥物化學(xué)家看到了潛在新藥的豐富來源。
“不尋常的位置會導(dǎo)致不尋常的多樣性，這將產(chǎn)生具有不尋�；顒�(dòng)的不尋常的化學(xué)反應(yīng)，而這作為一種策略，似乎已經(jīng)取得了很大的成效。”英國阿伯丁大學(xué)化學(xué)系主任Marcel Jaspars說。Jaspars和同事最初從事的是PharmaSea項(xiàng)目，這是一個(gè)多機(jī)構(gòu)合作項(xiàng)目，重點(diǎn)對海洋微生物組進(jìn)行測序，并從這些微生物中尋找新的代謝產(chǎn)物。反過來，這些化合物可能被證明在藥物開發(fā)項(xiàng)目中有用。PharmaSea項(xiàng)目于2017年結(jié)束，但Jaspars的團(tuán)隊(duì)仍在繼續(xù)探索海洋深處。
“對我們來說，研究基因組并為天然產(chǎn)品尋找感興趣的生物合成途徑是很酷的。”Jaspars表示。例如，許多抗生素最初是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的，而參與PharmaSea項(xiàng)目的研究人員還發(fā)現(xiàn)了具有抗氧化性和其他有前景的藥物特性的化合物�；蚪M數(shù)據(jù)揭示了這種有機(jī)體可以產(chǎn)生的大量代謝物，如蛋白質(zhì)和多肽很容易通過這種方式識別。但一些最有趣的化合物來自復(fù)雜的代謝途徑，僅從序列數(shù)據(jù)來看，這些代謝途徑并不明顯。為了解決這個(gè)問題，研究團(tuán)隊(duì)嘗試在培養(yǎng)基中培養(yǎng)這種細(xì)菌，以研究它們的新陳代謝。
這是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的過程。“我們必須嘗試多種不同的條件，看看能否得到有趣的代謝物表達(dá)。”Jaspars說。由于專注于研究海洋生物，Jaspars的實(shí)驗(yàn)室必須復(fù)制深海的極端條件。通過修改培養(yǎng)基和使用特殊設(shè)備，如將樣本置于相當(dāng)于幾公里海洋深度的壓力室，他成功培養(yǎng)出了許多以前被認(rèn)為無法培養(yǎng)的生物。Jaspars和同事們與位于加拿大安大略省多倫多的高級化學(xué)發(fā)展中心合作，確定了這種生物產(chǎn)生的代謝物。
在另一種方法中，該團(tuán)隊(duì)與微生物學(xué)家合作，在對實(shí)驗(yàn)室更友好的宿主中表達(dá)不可培養(yǎng)微生物的基因。“當(dāng)有基因簇在那里時(shí)，通常可以在另一個(gè)宿主上操縱它，而非在原宿主上。”Jaspars解釋道。
讓新的生物體在培養(yǎng)物中生長不僅僅是實(shí)驗(yàn)室研究的一個(gè)有用工具，也是將基于微生物組的治療方法引入臨床的重要一步。例如，初步臨床研究表明，將健康人的糞便細(xì)菌移植到患有慢性艱難梭菌感染的人體內(nèi)可以治愈感染。然而，將這一發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為監(jiān)管機(jī)構(gòu)可批準(zhǔn)的治療方法卻很困難，因?yàn)榧S便不是一種明確的藥品。
“要制造一種藥物，并且必須讓它能夠成長。”位于英國欣克斯頓的威康信托桑格研究所宿主—微生物相互作用實(shí)驗(yàn)室教師組負(fù)責(zé)人Trevor Lawley表示。在2012年的一篇開創(chuàng)性論文中，Lawley和同事們開始解決這個(gè)問題，成功地從健康小鼠的糞便中培養(yǎng)出18種細(xì)菌，并使用確定的培養(yǎng)物治愈了另一組患有艱難梭菌感染的小鼠。
和Jaspars一樣，Lawley將復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析與老式的試錯(cuò)法結(jié)合起來。“我們犯了很多錯(cuò)誤。”Lawley說。研究團(tuán)隊(duì)從一種培養(yǎng)基升級到另一種培養(yǎng)基，對每種培養(yǎng)基進(jìn)行檢查和測序，以確定哪些細(xì)菌仍然存在于原始糞便樣本中、哪些已經(jīng)消失。然后，他們修改了條件并再次嘗試。
Lawley的實(shí)驗(yàn)室最終開發(fā)出一套用于培養(yǎng)人類微生物組的培養(yǎng)基配方。“現(xiàn)在我們可以采集你的糞便樣本，在4周內(nèi)將90%~95%的物種進(jìn)行超純化并存檔。它使我們能夠制造藥物，并使表型生物學(xué)成為可能。”位于英國劍橋的生物技術(shù)公司Microbiotica正致力于將這種微生物療法應(yīng)用于臨床。
雖然制造藥物是最初的目標(biāo)，但這項(xiàng)工作對基礎(chǔ)研究有一個(gè)重大的附帶好處。“我認(rèn)為它改變了我們做宏基因組分析的方式，這實(shí)際上是非常有影響的。”Lawley說。通過培養(yǎng)大部分的人類腸道菌群，他的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)能夠?yàn)橹拔磁囵B(yǎng)的物種組裝完整的參考基因組。研究人員現(xiàn)在可以將這些參考基因組與他們在其他樣本中獲得的宏基因組序列進(jìn)行比較，從而極大地改善了數(shù)據(jù)。
身邊的真菌
細(xì)菌并不是唯一在人類腸道中安家的生物，盡管人們可能會從早期的微生物組學(xué)文獻(xiàn)中獲得這樣的印象。“很多研究都集中在細(xì)菌成分上，因?yàn)樗且环N容易實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)，也被認(rèn)為是影響健康和疾病的最大因素。”位于得克薩斯州休斯敦的貝勒醫(yī)學(xué)院分子病毒學(xué)和微生物學(xué)系主任Joseph Petrosino說。
Petrosino的實(shí)驗(yàn)室致力于開展人類微生物組計(jì)劃（HMP）。最近，研究人員開始研究真菌。“許多人認(rèn)為它們是病原體，但是健康個(gè)體的真菌多樣性是什么樣子的？”
聚焦于酵母和霉菌共同的基因組特征，研究人員在HMP糞便樣本中尋找真菌，進(jìn)而獲得了對正常人類真菌群落的初步觀察。結(jié)果顯示，“真菌群落的多樣性遠(yuǎn)不如細(xì)菌群落，而且隨著時(shí)間的推移也不太穩(wěn)定。”Petrosino說。自2017年發(fā)表這項(xiàng)工作以來，其他實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開始研究健康和患病腸道中的真菌群落。“這可能比細(xì)菌微生物組領(lǐng)域研究晚了5年左右。”
研究菌群的挑戰(zhàn)之一是樣品中的真菌相對稀缺。例如，在一個(gè)糞便樣品中，細(xì)菌DNA的絕對數(shù)量可以掩蓋真菌序列。同時(shí)，活檢樣本中往往含有大量宿主細(xì)胞。“有些方法的發(fā)展是有所幫助的，但還沒有真正邁出轉(zhuǎn)變范式的一步。”Petrosino坦言。
盡管如此，該領(lǐng)域已經(jīng)產(chǎn)生了一些誘人的結(jié)果。一項(xiàng)臨床研究表明，在沒有面包、啤酒、蘑菇和其他真菌來源的嚴(yán)格飲食中，個(gè)體最終會形成無真菌的腸道微生物群。“那么問題是我們吃這些食物是為了什么？它們對健康是有益還是有害？”Petrosino說。在另一個(gè)項(xiàng)目中，Petrosino實(shí)驗(yàn)室的研究人員正培養(yǎng)來自胃腸道活檢的3D細(xì)胞來研究各種真菌和腸道上皮細(xì)胞之間的相互作用。Petrosino希望將這些模型與額外的真菌群落測序數(shù)據(jù)相結(jié)合，從而繪制出細(xì)菌、真菌和宿主細(xì)胞之間相互作用的完整圖譜。
病毒式傳播
盡管具有挑戰(zhàn)性，但要將以前沒有表征的細(xì)菌和真菌進(jìn)行分類，仍然需要依賴于這些生物體的共同特征。例如，所有細(xì)菌都攜帶高度保守的16S核糖體RNA序列，這些序列隨著進(jìn)化時(shí)間的推移而緩慢變化。微生物組學(xué)研究中的一種常見策略是使用針對這些序列的PCR引物，然后根據(jù)它們的差異對樣本中的細(xì)菌進(jìn)行分類。
病毒沒有這樣的捷徑。相反，研究人員對病毒組的研究依賴于生物信息學(xué)。“有多種方法可以豐富對病毒序列的計(jì)算。”加州大學(xué)舊金山分校神經(jīng)外科助理教授Stephen Francis說。在一項(xiàng)對來自中國15萬名女性樣本的病毒多樣性大規(guī)模研究中，F(xiàn)rancis和同事進(jìn)行了高通量測序，然后減去所有與參考人類基因組匹配的序列。然后，他們在剩余的序列和已知病毒序列數(shù)據(jù)庫之間尋找匹配。
結(jié)果不僅揭示了眾所周知的病原體（比如人乳頭瘤病毒和乙型肝炎病毒）在人群中的廣泛分布，而且還揭示了已整合到患者基因組中的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列的有趣差異。“我們一直受到病毒的‘狂轟濫炸’，有時(shí)當(dāng)病毒內(nèi)生到我們的基因組中時(shí)，它可以為整個(gè)物種提供某種功能上的好處或損害，所以我認(rèn)為這是一個(gè)非常重要的事件，需要了解。”Francis表示。盡管這些古老的整合病毒序列曾被認(rèn)為是“垃圾DNA”，但最近的分析表明，它們對嬰兒進(jìn)化以及人群疾病風(fēng)險(xiǎn)的變化等方方面面都有貢獻(xiàn)。
Francis計(jì)劃擴(kuò)大病毒學(xué)分析范圍以覆蓋100萬名女性。他認(rèn)為，大規(guī)模的基于人群的研究將極大地促進(jìn)人們對病毒和健康之間關(guān)系的理解。由于樣本來自孕婦，研究人員可以尋找特定病毒和分娩結(jié)果之間的聯(lián)系。“子宮內(nèi)感染顯然是一個(gè)需要了解的重要方面，特別是對于塑造生命后期的免疫反應(yīng)。其他大型人群研究，比如英國生物銀行的研究，為研究人員提供了更多的樣本儲備。”
鏈上的鏈接
細(xì)菌學(xué)家也開始超越16S核糖體RNA測序。許多人現(xiàn)在已經(jīng)轉(zhuǎn)向宏基因組研究，包括對樣本中所有DNA進(jìn)行測序，并嘗試根據(jù)數(shù)據(jù)組裝完整的細(xì)菌基因組。盡管這些項(xiàng)目近年來取得了令人矚目的進(jìn)展，但細(xì)菌生命的另一個(gè)重要方面——質(zhì)粒仍難以研究。
作為保持自身與細(xì)菌基因組分離的一種小的環(huán)狀DNA元素，質(zhì)粒提供了一個(gè)深層次的基因庫，這些基因庫通常會賦予宿主諸如抗生素耐藥性、新的代謝能力和毒性等特性。
“你可以使用常規(guī)測序來了解微生物群落中質(zhì)粒的種類，但不能將這些質(zhì)粒與它們所在的細(xì)菌宿主聯(lián)系起來。”莫斯科愛達(dá)荷大學(xué)生物科學(xué)教授Eva Top說。許多質(zhì)粒是混雜的，很容易在不同種類的細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移，所以即使科學(xué)家發(fā)現(xiàn)與一個(gè)物種相關(guān)的特定質(zhì)粒，也不能證明它在其他物種中不存在。同時(shí)，一種細(xì)菌的某些菌株可能攜帶質(zhì)粒，而另一些菌株可能不攜帶，并且在微生物生態(tài)系統(tǒng)中，質(zhì)粒的分布會隨著時(shí)間的推移而改變。
為了解決這個(gè)問題，Top和同事們采用了一種名為“鄰近連接”的技術(shù)，該技術(shù)最初用于在免疫檢測中將抗體連接在一起。通過修改這種方法，研究人員能夠在裂解細(xì)菌進(jìn)行測序之前結(jié)合質(zhì)粒與宿主基因組。然后，他們可以獲得宿主染色體及其相關(guān)質(zhì)粒的序列數(shù)據(jù)，從而能夠分析質(zhì)粒在不同微生物組中的運(yùn)動(dòng)動(dòng)力學(xué)。
“我們當(dāng)然對質(zhì)粒的基礎(chǔ)生物學(xué)很感興趣，但也對抗生素耐藥性問題以及質(zhì)粒在耐藥性傳播中所起的作用感興趣。”Top說。到目前為止，她的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)揭示了某些細(xì)菌群體特別擅長提取帶有抗生素抗性基因的質(zhì)粒，其可能作為耐藥性的儲存庫，然后傳播到致病物種。研究人員還開始分析新引入的質(zhì)粒是如何通過微生物組傳播的，例如當(dāng)動(dòng)物糞便中攜帶抗生素抗性的質(zhì)粒遇到農(nóng)田中的土壤微生物組時(shí)。
不管他們采用何種具體方法，推動(dòng)基因組學(xué)向新方向發(fā)展的科學(xué)家們對未來都很樂觀。正如Petrosino解釋的那樣，“幾十年來，研究人員一直在研究共生生物，但現(xiàn)在這項(xiàng)技術(shù)開始幫助我們提出不同類型的問題。”■
參考文獻(xiàn)
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2. A. K. Nash et al., Microbiome 5, 153 (2017).
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Alan Dove是馬薩諸塞州的科學(xué)作者和編輯。
鳴謝：“原文由美國科學(xué)促進(jìn)會（www.aaas.org）發(fā)布在2020年10月9日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請見https://www.science.org/content/article/genomics-comes-full-circle。