縱觀生物成像的歷史，科學(xué)家和工程師為看得更多攜手并進(jìn)。有時(shí)，取得進(jìn)步，我們得以用更高的分辨率來觀察事物；有時(shí)他們幫助我們更深入地觀察樣本。然而，生物學(xué)家希望同時(shí)做到以上兩方面，促進(jìn)了新的方法，如多光子顯微鏡的誕生。
在共聚焦顯微鏡下，單個(gè)光子激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記。在雙光子顯微鏡（多光子顯微鏡的最常見形式）中，標(biāo)記幾乎在同一瞬間吸收了兩個(gè)光子。多光子顯微鏡還使用波長更長的光子，它們能量較低，穿透力更深，在對更遠(yuǎn)的樣本成像時(shí)對組織的損害較小。
隨著生物技術(shù)的改進(jìn)，或新方法的發(fā)展，解析生物樣本中深層結(jié)構(gòu)的能力不斷發(fā)展，同時(shí)在制備，操作和分析方面仍需要相當(dāng)多的專業(yè)知識。在許多方面，科學(xué)進(jìn)步的這兩個(gè)關(guān)鍵要素（技術(shù)和工藝）正協(xié)同發(fā)展，有助于成像揭示更多的生物世界。
技術(shù)整合
科學(xué)家們需要商業(yè)平臺來擴(kuò)大多光子成像的使用范圍。尼康公司的A1R HD多光子共聚焦顯微鏡就是其中之一。該公司位于紐約市梅爾維爾。這款顯微鏡的一個(gè)主要特點(diǎn)是以每秒30幀的速度采集整個(gè)視場的數(shù)據(jù)。尼康公司生物系統(tǒng)的產(chǎn)品經(jīng)理Adam White說：“有了A1R HD，科學(xué)家可以高速捕捉高質(zhì)量的圖像”。
蔡司公司（德國奧伯科亨）生產(chǎn)的LSM 880 Airyscan能夠提供多光子成像。蔡司公司決策部經(jīng)理和應(yīng)用開發(fā)工程師Joseph Huff說。“加入Airyscan探測器可將信噪比提高4至8倍，在小鼠大腦上使用這種設(shè)置，我們可以獲取深度達(dá)500微米的數(shù)據(jù)。”
然而，深焦會(huì)有一些弊端。奧林巴斯產(chǎn)品經(jīng)理Carlo Alonzo說：“隨著深入組織，球面像差的數(shù)量會(huì)增加。“這不僅會(huì)降低焦距，導(dǎo)致分辨率降低，而且由于多光子激發(fā)的效率降低，圖像也會(huì)變暗。”
為此，奧林巴斯開發(fā)了TruResolution物鏡。Alonzo解釋：“電動(dòng)光學(xué)校正環(huán)可根據(jù)顯微鏡的z焦點(diǎn)動(dòng)態(tài)調(diào)整，” 通過使這一過程自動(dòng)化，這些物鏡提供了一個(gè)體積圖像，可以更好地保持從頂部到底部的z-stack亮度和分辨率。該物鏡可與奧林巴斯FLUOVIEW FVMPE-RS多光子顯微鏡一起使用，安裝簡便。使用該設(shè)備，研究人員可以更輕松地捕獲組織深處的細(xì)小特征，例如神經(jīng)元上的亞微米大小的樹突棘。
捕獲透明組織
不僅提升硬件可以改善深部組織成像，組織透明技術(shù)也可以。它可使樣品幾乎透明，從而使得在更深層次的成像變得更容易。
Visikol公司（位于新澤西州懷特豪斯站）的首席科學(xué)官Tom Villani指出，除了讓光子進(jìn)入組織更深處，“許多清除劑可以穩(wěn)定熒光團(tuán)，這是有用的副作用。”另外，Visikol HISTO透明劑易于使用。“我讓高中實(shí)習(xí)生清除組織！” Villani說。
組織類型會(huì)影響過程。 Villani說：“大腦，皮膚和肺部都很容易，但是腎臟和肝臟等色素豐富的組織更難。”顯微鏡也很重要。在幾乎任何共聚焦范圍內(nèi)，都可以在Visikol HISTO清除的組織中1~2 mm處獲得圖像。他說：“你需要雙光子或光片熒光顯微鏡和水浸物鏡才能超過4毫米深度。”
為了從透明化樣品中獲得特別清晰的圖像，尼康開發(fā)了一種新的20倍甘油浸沒物鏡。它具有較高的數(shù)值孔徑（1.0）和良好的工作距離（8.2 mm）。為了達(dá)到這種清晰度，物鏡必須很大：它的長度為90毫米，直徑為48毫米——兩者的尺寸均比平均20倍的物鏡大50％。
蔡司的Lightsheet Z.1顯微鏡適用于透明化樣品。Huff說：“對于大塊組織成像，組織透明化試劑和光片是不錯(cuò)的選擇。”該成像平臺包括從右側(cè)和左側(cè)的照明路徑。因此，蔡司光學(xué)顯微鏡北美產(chǎn)品營銷小組經(jīng)理Scott Olenych說：“您可以看到實(shí)時(shí)成像的共焦深度是原來的兩倍。”盡管增加了深度，使用光片技術(shù)的真正好處是速度。“相比之下，共焦成像相當(dāng)慢，” Olenych解釋說。“光片可以穿過幾毫米甚至更深，因?yàn)樗褂谜障鄼C(jī)而不是光電倍增管。”
描繪發(fā)病機(jī)制
在加爾維斯頓的德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)分院，內(nèi)科教授Joan Nichols和她的同事使用多光子顯微鏡研究人類疾病的發(fā)病機(jī)制。疾病過程通常涉及細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（支撐細(xì)胞的支架）的變化。為了了解這些過程，Nichols樂于對基質(zhì)以及產(chǎn)生和修改基質(zhì)的活細(xì)胞的變化進(jìn)行成像。她說：“在基質(zhì)中，多光子的效果驚人。它可以讓你做一些深層的成像：在100微米或更高。”從這個(gè)深度，她可以更好地評估組織，細(xì)胞和支持胞外基質(zhì)中發(fā)生疾病驅(qū)動(dòng)的變化。她說：“我們可以同時(shí)做控制組和實(shí)驗(yàn)組，并在選定的時(shí)間段內(nèi)反復(fù)成像。”
這項(xiàng)工作的關(guān)鍵是在疾病發(fā)展的過程中將目光投向同一個(gè)地方。使用傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡，樣品可固定并逐片成像。Nichols解釋說“但是隨著時(shí)間的推移，在沒有固定組織的情況下觀察控制組和實(shí)驗(yàn)組的組織可以讓你看到實(shí)時(shí)的變化——反復(fù)到同一個(gè)點(diǎn)去尋找那個(gè)區(qū)域的變化。”
Nichols和她的同事研究的疾病是肺纖維化。為此，他們通過制作3D培養(yǎng)的細(xì)胞（類器官）來開發(fā)生物工程化的肺組織，模仿人體器官的特征。這種類器官可以用多光子顯微鏡成像，以比較并分析健康和纖維化或病變的組織。
“通往大腦的‘窗口’”
但有時(shí)光有類器官還不夠。在瑞士蘇黎世大學(xué)，神經(jīng)科學(xué)教授Sebastian Jessberger利用多光子顯微鏡研究活體小鼠的大腦，以了解哺乳動(dòng)物的海馬體是如何在整個(gè)生命周期中產(chǎn)生神經(jīng)元的，尤其是在一種被稱作齒狀回的結(jié)構(gòu)中。此前，Jessberger曾研究固定細(xì)胞，但他希望有更好的方法來研究神經(jīng)元的產(chǎn)生。因此，通過精心的手術(shù)，Jessberger將海馬體暴露在腦部，并在大腦中制造了一個(gè)“窗口”，可以在小鼠繼續(xù)表現(xiàn)出正常行為范圍的幾個(gè)月甚至幾年間內(nèi)，用于實(shí)時(shí)成像。
Jessberger標(biāo)記小鼠的干細(xì)胞，并通過多光子顯微鏡追蹤這些細(xì)胞。他解釋說：“我們觀察了出生在成年海馬體中的神經(jīng)元和在胚胎發(fā)育中的神經(jīng)元，由此試圖了解在細(xì)胞水平上發(fā)生了什么。”到目前為止，該技術(shù)的成像深度達(dá)到約1毫米。
Jessberger希望使用三光子顯微鏡（由Chris Xu和紐約州伊薩卡市康奈爾大學(xué)的Xu研究小組共同開發(fā)）看到可能是2毫米或更深的范圍。他說：“最終，我們希望能夠在不去除部分皮質(zhì)的情況下到達(dá)齒狀回或海馬體。”
有了這些進(jìn)展，Jessberger和他的同事們期望探索大腦發(fā)育的更多方面。例如，稱為少突細(xì)胞的膠質(zhì)細(xì)胞將髓磷脂添加到某些神經(jīng)元的外面，從而提供絕緣作用，加速電信號在這些細(xì)胞中的流動(dòng)。Jessberger希望能長期追蹤這些細(xì)胞。他說：“也許我們可以學(xué)會(huì)預(yù)測哪些細(xì)胞可以脫髓鞘，哪些細(xì)胞不能。”這可以幫助科學(xué)家更好地理解多發(fā)性硬化癥等疾病，這些疾病源于髓鞘形成缺陷。
LaVision BioTec（德國貝吉施格拉德巴赫Miltenyi Biotec公司）的科學(xué)家對三光子顯微鏡的價(jià)值表示贊同。LaVision BioTec的高級產(chǎn)品專家Rafael Kurtz說： “由三個(gè)光子引起激發(fā)時(shí)，雙光子激發(fā)給深層組織成像帶來的巨大優(yōu)勢將成倍增加。我們證明了三光子激發(fā)在各種不同組織中進(jìn)行深層組織成像的優(yōu)勢。”
一種好處是能夠穿透骨骼，這可以改善大腦研究。Kurtz指出：“到目前為止，必須在頭骨上切開一個(gè)窗口，才能實(shí)現(xiàn)腦部顯微成像，三光子成像由于其出色的骨骼滲透能力，現(xiàn)在可以對大腦活動(dòng)進(jìn)行全顱成像。”
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是骨成像本身就是三光子顯微鏡的一種應(yīng)用。LaVision BioTec公司的科學(xué)家利用三光子成像和1700納米左右的激發(fā)，用“紅色熒光染料和THG(三次諧波產(chǎn)生)信號創(chuàng)建了清晰的圖像，其深度幾乎是經(jīng)典雙光子顯微鏡所達(dá)到的兩倍”。Kurtz說：“造血，干細(xì)胞遷移和免疫學(xué)記憶的關(guān)鍵步驟隱藏在骨髓深處。用三光子顯微鏡對骨髓進(jìn)行長期的腔內(nèi)成像將有助于探索這些問題。”
發(fā)揮作用
多光子顯微鏡比過去容易得多，但它與常規(guī)的光成像有很大的不同。Jessberger說：“它不像一個(gè)普通的共焦，你買了放在工作臺上，它就可以工作，你需要一個(gè)了解物理學(xué)且至少可以部分使用的人。并且它還需要時(shí)常進(jìn)行調(diào)整。”
Nichols對于需要專家協(xié)助表示認(rèn)同。她說：“我們要與一個(gè)外部團(tuán)隊(duì)密切合作，幫助我們設(shè)置成像和評估，大多數(shù)科學(xué)家需要依靠顯微鏡專家與他們合作。”事實(shí)上，多數(shù)大型大學(xué)也都雇傭了專門從事多光子顯微鏡研究的內(nèi)部人員。
Nichols提到了多光子用戶面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn)：可用性。有些設(shè)施將配備一些儀器，但并非總是如此。
僅僅想要多光子成像是不夠的�？茖W(xué)家還需要購買或預(yù)約要用的儀器，培養(yǎng)這種類型成像所需的技能，并學(xué)會(huì)準(zhǔn)備樣品以獲得最佳結(jié)果。
創(chuàng)建組合
最大的進(jìn)步可能來自于將先進(jìn)的成像技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合。例如，Jessberger描述了他的小組在對相同細(xì)胞的克隆或集群進(jìn)行成像，然后觀察其RNA的方法。他說：“你可以利用這些細(xì)胞中RNA含量的知識，然后在一定時(shí)間內(nèi)追蹤這些細(xì)胞的確切歷史記錄。”他補(bǔ)充說，這些類型的研究開始將分子機(jī)制與一系列解剖學(xué)變化聯(lián)系起來。
Nichols還結(jié)合技術(shù)研究肺功能。她利用顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)來觀察整個(gè)肺部的呼吸樹，并利用多光子顯微鏡來觀察細(xì)胞層面的結(jié)構(gòu)變化。
生物學(xué)家才剛剛開始探索多光子顯微鏡技術(shù)，具有清除技術(shù)的深層組織成像以及其他技術(shù)的可能組合。當(dāng)然，隨著越來越多的科學(xué)家加入，這些成像技術(shù)將會(huì)有更廣泛的用途，也會(huì)有意想不到的發(fā)現(xiàn)�！�
（譯者李楠是中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院副研究員）
作者M(jìn)ike May 是美國德克薩斯州的自由撰稿人。
鳴謝：“原文由美國科學(xué)促進(jìn)會(huì)（www.aaas.org）發(fā)布在2019年3月22日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請見https://www.sciencemag.org/features/2019/03/shedding-light-deep-tissue-multiphoton-microscopy。