在過去的幾年里，分子生物學家們認識到一個令人驚恐的事實：他們在實驗中需要用到的一些關鍵性的試劑竟然效果不穩(wěn)定，以致于他們之前所做的大量工作的結果可能是錯誤的。出現(xiàn)這個問題的主要原因在于抗體，這是研究人員從定量受體表達到純化關鍵基因產(chǎn)物一直都在使用的一類蛋白質。
在過去，科研人員如果需要某個蛋白質的抗體，他們要么自己制備，要么從同事那里獲得。雖然這很簡單，但過程卻乏味無聊，并且很花時間。隨著基因組學和蛋白質組學的興起，這種手工方法再也無法給研究人員提供其所需的大量抗體。有需要就有市場，抗體生產(chǎn)行業(yè)應運而生，以滿足日益增長的需求。然而事與愿違，低準入門檻和巨大利潤的誘惑使得大量可疑的試劑很快就占領了市場�，F(xiàn)在，研究人員正在試圖找出問題原因并盡力改善現(xiàn)狀。
在加州圣地亞哥的One World Lab是一家主要致力于簡化抗體驗證過程的抗體經(jīng)銷公司，他們的總裁兼首席執(zhí)行官Mike Simson說：“我認為這是一個日益嚴重的問題，因為它無處不在，每年都有數(shù)億美元的浪費。在這一點上，市場上的可疑試劑現(xiàn)在已經(jīng)有失控的趨勢了。”
輕鏈，重鏈和供應鏈
大多數(shù)科研人員不知道的是，很多供研究使用的抗體會沿著迷宮般的供應鏈進入實驗室。少數(shù)供應商在自己的工廠里制造抗體，但多數(shù)知名供應商的運作方式則像百貨公司。如同中國深圳的大量工廠生產(chǎn)著世界上大部分的電子設備一樣，中國武漢也有眾多生產(chǎn)抗體的企業(yè)。供應商購買這些產(chǎn)品，然后把自己的品牌和股票號碼放在上面做貼牌銷售。因此，看似是市場上有諸多品牌進行競爭，為消費者提供了多種產(chǎn)品選擇，但是實際上銷售的卻是一個比消費者看到的要小得多的產(chǎn)品集合。
研究人員經(jīng)常是從某個供應商購買了一種抗體，發(fā)現(xiàn)這種抗體并不適用于他們的研究，然后就換一下供應商訂購另一種抗體產(chǎn)品，但是他們完全沒有想到它們本質上是同一種產(chǎn)品。購買一種產(chǎn)品需要花費數(shù)百美元，研究人員通常會在這些重復的購買行為中浪費數(shù)千美元。更糟糕的是，當一種抗體在發(fā)表文章時表現(xiàn)得足夠好時，下一批抗體可能會令人失望，研究人員也無法追蹤問題。“如果你的結果沒有可追溯性，你就沒有問責機制，那么你就沒有重現(xiàn)性。沒有重現(xiàn)性，就沒法談科學了，” Simson說。
為了解決這個問題，One World Lab提供了來自大約40家不同制造商的完全可溯源的抗體產(chǎn)品，并以樣品大小的試劑盒出售。研究人員可以針對特定的目標訂購一組真正不同的抗體，然后對它們進行測試并找出最適合它們的抗體。Simson稱這種做法對抗體制造商和研究人員都有好處，他說：“需要有這么一個地方，數(shù)據(jù)可以得到反饋，以便公司都能了解他們的產(chǎn)品效果如何。”
不幸的是，雖然研究人員似乎很珍視One World Lab的服務，但他們并不想為此買單。Simson說：“我們在實踐中發(fā)現(xiàn)，研究人員購買抗體樣品試劑盒，對其進行測試，并確定哪些試劑有效，然后就直接向制造商去購買了。他們應該通過One World Lab來購買，以保持這個平臺可以生存。”令人遺憾的是，Simson的擔憂并非無的放矢，該公司最近宣布將關閉這項服務。Simson在公司網(wǎng)站上發(fā)布的一則公告中強調，盡管One World Lab的商業(yè)模式需要調整，但“產(chǎn)品的透明度和性價比對推動科學發(fā)展十分重要”。目前還不知道將來是否會有其他公司能夠更好地提供這一服務。
陽性選擇和陰性選擇
除了呼吁供應鏈更加透明之外，該領域的許多專家還主張建立一套更正式的、全行業(yè)通用的標準來檢驗這些試劑的質量。人類蛋白質圖譜項目的負責人、瑞典斯德哥爾摩KTH Royal Institute of Technology生命科學實驗室的教授和創(chuàng)始人Mathias Uhlén說：“顯然，我們需要清晰的列出一些對研究人員來說更有用的試劑。”
Uhlén和他的同事在開發(fā)人類蛋白質圖譜時需要考慮抗體驗證的問題，該圖譜制備了數(shù)以千計的抗體來檢測蛋白質在整個人體組織中的表達模式。Uhlén還倡議組建了抗體驗證國際工作組（IWGAV），該工作組去年10月發(fā)布了擬定的指南。大約在同一時間，世界生物學標準研究所（GBSI）在加利福尼亞州太平洋格羅夫的斯洛瑪爾會議場舉辦了一次會議，并成立了工作組繼續(xù)討論這個問題。
IWGAV和GBSI制定的所有新標準都有兩個基本原則。Uhlén說：“抗體必須針對特定的應用方式進行驗證。”例如，一種抗體適用于對凝膠中變性的蛋白質進行分子印跡，無法作為證據(jù)推斷在非變性檢測中（比如熒光激活細胞分選）它同樣有效。其次，新標準要建立實驗流程或者叫框架方案，用來規(guī)范一個抗體必須通過哪些測試才能確定可以進行某種特定應用。
每個框架方案使用不同的技術和方法來對抗體的有效性進行驗證。例如，研究人員可以采用一種遺傳學方法，敲除或降低抗體假定目標的基因表達，并檢驗這是否消除了抗體的結合位點。另一種方法是利用待測試的抗體純化目標蛋白，然后通過質譜法確定蛋白的同一性。
盡管這些抗體驗證標準的建立大體上都遵循了相似的原則，但仍存在一些爭議。其中一個爭論的焦點是驗證結果是應該劃定一條及格線，還是應該給出一個榜單以便在相同的目標和應用中獲得不同抗體的評分來判斷它們彼此的相對效果。Uhlén傾向于前者，而GBSI則傾向于后者。
要讓科研人員就這些標準達成一致已經(jīng)很困難，應用它們就更難了。Uhlén的團隊一直在系統(tǒng)地測試用于人類蛋白圖譜的所有抗體，看看它們是否符合新標準。Uhlén說：“我們的目標是三到四年，也許五年后，我們將只有那些已經(jīng)被正式驗證過的，至少通過蛋白質圖譜中有一個框架方案測試的抗體；但這已經(jīng)需要大量的投入，我們正為此而努力。”
對于絕大多數(shù)尚未在新定義的標準下得到驗證的商業(yè)化抗體，最終用戶可能需要自行處理。在尚未具備基因敲除或質譜功能的實驗室中，一種新的RNA原位雜交方法可能會對研究人員有所幫助。
RNA雜交傳統(tǒng)上是一項棘手的技術，但是一家總部位于加州紐瓦克的生物技術公司Advanced Cell Diagnostics（ACD）希望改變這一現(xiàn)狀。該公司的RNAScope系統(tǒng)使用特定的探針和標記物來快速、穩(wěn)定地量化細胞或樣本中的RNA水平。雖然RNA的轉錄不能完全反映蛋白質的表達，但研究者可以利用相關性作為檢驗抗體的一種簡單方法。ACD市場副總裁Chris Silva表示：“RNAScope確實是一種驗證蛋白質表達的正交方法，它允許使用者將RNA轉錄量作為以后翻譯成的蛋白質的前體來進行驗證。”目標蛋白的抗體結合水平若明顯不同于其RNA水平，將為抗體的質量問題提供早期預警。
研究人員還可以使用RNA分析技術來縮小靶蛋白的范圍，然后再根據(jù)需要來訂購相對昂貴的抗體。Silva表示他的公司可以在幾周內為任何序列提供定制的RNAScope探針，來加速篩選值得進行抗體研究的目標蛋白。
保持命中率
盡管一些評論人士將目前的形勢描述為一場危機，但業(yè)內資深人士認為，這是一個由來已久的問題，只是終于引起了人們的注意。位于英國劍橋的Abcam公司新產(chǎn)品開發(fā)副總裁Alejandra Solache表示她不認為這是一個新的問題。她解釋說：“我們用于抗體驗證的新工具實際上讓我們更清醒地認識到我們常用工具存在一些潛在缺陷，比如我們過去一直在使用的某些抗體。”
由于研究人員對抗體驗證并不太重視，所以制造商對這個領域的興趣也不是很大。“研發(fā)抗體的大部分成本來自于驗證；這可能是一些公司一直在努力降低成本而不太重視的地方，”Solache說。
Abcam的目標是為抗體的生產(chǎn)和檢測制定高標準。Solache補充說提供高質量的產(chǎn)品是他們公司的責任；隨著可以用于抗體驗證的新技術的逐漸興起，他們正在嘗試在更大的范圍內使用這些技術，這樣他們就能更好地評估這些產(chǎn)品。同時，Solache也表示他們公司已經(jīng)利用Uhlén和他的同事們所倡導的技術驗證了許多抗體。
Abcam是市場上重要的“雜合型”抗體供應商之一，他們的主營業(yè)務包括銷售他們自己研發(fā)的抗體和其他公司貼牌生產(chǎn)的抗體。Solache堅稱他們會仔細選擇供應商，并補充解釋要求供應鏈完全透明是有問題的——供應商通常會與制造商簽訂合同，禁止公開這種關系。她說：“我認為，如果抗體的質量很好，這種不透明就不一定是問題。我們需要先解決質量問題。”
對于那些只關心在哪里能買到好抗體的研究人員來說，Solache給出的建議是尋找提供驗證數(shù)據(jù)的公司。無論是在公司網(wǎng)站或者獨立的評論頁面上，對于特定抗體的評價，都可以為抗體的選擇提供很好的參考。
像Abcam這樣的大供應商在投資新的抗體驗證技術時，小公司也會擔憂自己的問題，特別是那些專門從事抗體生產(chǎn)的公司。這些公司必須首先決定選用哪些抗原來開發(fā)抗體，并試著猜測它們的需求量有多大。伊利諾伊州羅斯蒙特市Proteintech公司的首席執(zhí)行官Jason Li說：“科學本身的定義決定了有人要從事前沿的研究工作。”這家公司專注于抗體，ELISA和蛋白質。Li補充說：“科研人員需要一些抗體試劑來進行他們自己的前沿研究，而這樣的試劑以前從來沒有人用過。對于制造商來說，這其實是一件非常困難的事情，因為沒有人能夠預測科學的發(fā)展。”
這個難題使得抗體制造業(yè)在某些方面與電影和音樂行業(yè)相似。抗體制造商推測哪些抗原可能成為受歡迎的目標，進而投資進行其對應抗體的開發(fā)，并進行驗證，然后看銷售情況。Li估計大約有一成被選中的抗體會脫穎而出，其他九成的抗體則會被打入冷宮。人們希望，這十分之一的命中結果帶來的利潤能夠為未來十種抗體的開發(fā)提供資金，并使周期持續(xù)下去。
近年來，多種因素的影響導致這種營銷模式發(fā)生了動搖。Li說，抗體供應商一直靠從制造商的利潤中分成，而導致先前為了快速回報而向抗體制造商投資的金主現(xiàn)在選擇撤資。隨著預算縮減，很容易發(fā)現(xiàn)哪里削減支出比較容易。“總投入中三分之二的錢是用來驗證抗體，而制作一個抗體的花費只有三分之一，”Li說。不透明的供應鏈加劇了這個問題，使研究人員無法確定劣質抗體的來源。
“解決這個問題的唯一方法就是增加透明度，”Li表示，他還提出了一個設想，在未來，“每個抗體的生產(chǎn)流程都能夠向研究人員進行全方位開放，包括原產(chǎn)地，制作工藝流程，適用領域和局限性等。”
源頭上的改變
當抗體制造商和供應商在透明度和標準上苦苦掙扎時，研究人員也在嘗試另辟蹊徑。位于馬薩諸塞州丹佛市的科研和診斷試劑公司Cell Signaling Technology 的首席科學官Roberto Polakiewicz說：“抗體有好有壞；有知道如何使用它們的人，也有不知道如何正確使用它們的人。”
Polakiewicz解釋說，許多有經(jīng)驗的研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如何通過尋找數(shù)據(jù)來搜索商業(yè)化抗體的有效性信息。可信度較高的抗體供應商現(xiàn)在通常會向科研人員提供數(shù)據(jù)，來介紹他們目錄中的每一種抗體是如何被驗證的。有自主測試能力的實驗室也可以自行檢驗他們所訂購的抗體。在實驗中計劃使用的特定實驗流程也是采購中應該考慮的因素。“例如，當你使用免疫熒光法時，如果你使用的是錯誤的固定方法或固定劑，即使是使用了很好的抗體，也可能會得到錯誤的結果，”他說。
即使在實驗結果被發(fā)表了以后，也不能忽視對抗體使用細節(jié)的記錄。“如果你想重復一篇論文中的結果，清楚所有方法的來龍去脈是尤為重要的，”Polakiewicz說。但是他也補充道，研究人員在這方面的記錄是參差不齊的。沒有報告抗體來源和貨號的論文其實很難重復。
批號也非常重要，但是往往會被忽略；作為一種生物產(chǎn)品，抗體的效果很容易隨批次而變化。好的供應商往往津津樂道于宣傳他們的質量控制程序。但為了獲得最大的可靠性，研究人員應該嘗試用同一批次的抗體進行一系列的實驗。
對于抗體供應商和研究人員來說，最終解決抗體驗證問題的方法將是依靠科學研究的基本原理。“說到底，這更多的是要以扎實的研究為基礎，開發(fā)一種抗體并對其進行驗證，就像要做好一個實驗一樣，需要正確的實驗操作和合理的實驗設計，”Polakiewicz強調道。■
（譯者李楠是中國科學院深圳先進技術研究院副研究員。）
本文作者Alan Dove是馬薩諸塞州的一位科學作家和編輯。
DOI: 10.1126/science.opms.p1700116
鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發(fā)布在2017年9月14日《科學》雜志”。官方英文版請見http://www.sciencemag.org/features/2017/09/agreeable-antibodies-antibody-validation-challenges-and-solutions。