聚焦循環(huán)系統(tǒng)
腫瘤活檢是醫(yī)學(xué)研究中最麻煩、最危險(xiǎn)、最昂貴的一類檢查，研究人員數(shù)十年來(lái)一直在努力改進(jìn)它們。雖然日趨靈敏的檢測(cè)方法使醫(yī)生能夠從某些實(shí)體腫瘤中提取更小的樣本，但腫瘤學(xué)專家長(zhǎng)期以來(lái)一直夢(mèng)想著開(kāi)發(fā)一種可以完全避免傳統(tǒng)方式的活檢手段。所以科研人員將目光投向了液體活檢，這是一種利用血液或其他容易獲取的體液（如唾液）中的生物標(biāo)記物檢測(cè)和分析實(shí)體腫瘤的檢測(cè)方法。
腫瘤經(jīng)常將細(xì)胞和亞細(xì)胞成分釋放到血液中，但是通常它們很難被發(fā)現(xiàn)。即使在癌癥晚期，健康細(xì)胞和游離生物分子在血液中的濃度仍然比大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物高好幾個(gè)數(shù)量級(jí)。研究人員正在使用新型的純化和分析技術(shù)，將幾類的液體活檢方法推向臨床。
該領(lǐng)域內(nèi)主要有三種檢測(cè)手段：檢測(cè)游離核酸，分離完整的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，以及從腫瘤中識(shí)別細(xì)胞外囊泡。三種方法瑕瑜互見(jiàn)。通過(guò)一些已經(jīng)批準(zhǔn)用于臨床的液體活檢和臨床試驗(yàn)結(jié)果，該領(lǐng)域的專家們一致認(rèn)為，這些方法的應(yīng)用將帶來(lái)重大突破。
小反應(yīng)，大作用
在這三種方法中，基于核酸的液體活檢在早期處于核心地位。馬薩諸塞州波士頓丹娜—法伯癌癥研究所(Dana-Farber Cancer Institute)貝爾佛應(yīng)用癌癥研究中心的轉(zhuǎn)化研究實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人Cloud Paweletz認(rèn)為將來(lái)基于無(wú)細(xì)胞的DNA液體活檢方法接受程度和應(yīng)用范圍會(huì)變得廣泛，主要是因?yàn)樗谂R床中的應(yīng)用難度很低，易于掌握。他解釋說(shuō)，基于DNA的液體活檢通常使用標(biāo)準(zhǔn)的采血管即可，而且基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的活檢對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室人員來(lái)說(shuō)特別容易理解，實(shí)施起來(lái)很容易。
Paweletz和他的同事們正在開(kāi)發(fā)一種基于PCR的檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于肺癌耐藥性突變的檢驗(yàn)。這項(xiàng)測(cè)試在標(biāo)準(zhǔn)血液樣本中進(jìn)行，僅需要兩天時(shí)間，可以識(shí)別出影響40%肺癌患者的三種突變中的任何一種。該團(tuán)隊(duì)正在積累臨床活檢經(jīng)驗(yàn)，以建立腫瘤學(xué)檢測(cè)方法。
Geoff Oxnard是波士頓丹娜-法伯癌癥研究所和哈佛醫(yī)學(xué)院的助理教授，也是Paweletz的合作者之一。他評(píng)論道：“上周我遇到一個(gè)病人，因?yàn)檗D(zhuǎn)移性肺癌住院，她正是那種可能有上皮生長(zhǎng)因子受體EGFR突變的患者，但我無(wú)法獲取足夠的組織樣品來(lái)進(jìn)行研究。”Oxnard補(bǔ)充說(shuō)，通過(guò)目前丹娜—法伯癌癥研究所開(kāi)發(fā)的液體活檢方法，他能夠確定這位患者確實(shí)有相應(yīng)的突變，這將使她成為針對(duì)該突變的藥物試驗(yàn)的候選受試者。
Paweletz說(shuō)：“臨床需要推動(dòng)這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，而這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用也將為臨床診治提供新的能力”。除了基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測(cè)，他的團(tuán)隊(duì)還在設(shè)計(jì)其他液體活檢方法，如利用二代測(cè)序技術(shù)（NGS）來(lái)識(shí)別更廣泛的腫瘤和突變類型。
對(duì)于以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)，包括Paweletz和Oxnard在內(nèi)的許多液體活檢開(kāi)發(fā)人員發(fā)現(xiàn)，利用常規(guī)的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）技術(shù)是存在缺陷的。即使在對(duì)樣本先進(jìn)行純化，在待測(cè)體液中來(lái)自健康細(xì)胞的核酸也會(huì)多于來(lái)自腫瘤的核酸。大量qPCR樣本中的早期偏差將在隨后的周期中被放大，淹沒(méi)了腫瘤的信號(hào)。加州赫拉克勒斯伯樂(lè)（Bio-Rad）的體外診斷部研發(fā)經(jīng)理Dawne Shelton說(shuō)：“無(wú)細(xì)胞液體活檢的問(wèn)題在于，野生型DNA的量可能非常非常高，因此，要避免真正罕見(jiàn)的信號(hào)被野生型淹沒(méi)……這是關(guān)鍵”。
為了解決這一問(wèn)題，研究人員采用了一種叫做數(shù)字PCR的技術(shù)，將樣本中的游離DNA分離到只包含單個(gè)模板的許多微反應(yīng)中。例如，在Bio-Rad的液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)中，擴(kuò)增步驟之前，噴霧機(jī)將一個(gè)樣品分割成成千上萬(wàn)個(gè)納米尺度的微液滴。PCR反應(yīng)發(fā)生在單個(gè)液滴內(nèi)部，然后機(jī)器利用熒光標(biāo)記的信號(hào)進(jìn)行分選，以檢測(cè)目標(biāo)序列。
與NGS相比，數(shù)字PCR相對(duì)簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，對(duì)于剛剛開(kāi)始進(jìn)行液體活檢技術(shù)研究的人來(lái)說(shuō)，這是一個(gè)不二選擇。盡管如此，Shelton警告說(shuō)，這項(xiàng)技術(shù)需要仔細(xì)考慮生物學(xué)家可能很少關(guān)注的問(wèn)題。她說(shuō)：“我們所做的大多數(shù)液體活檢都是針對(duì)微量的樣品。因此，使用不合適的樣品提取方式或未優(yōu)化的試劑盒可能導(dǎo)致大量信號(hào)的遺失。”她補(bǔ)充說(shuō)，這個(gè)微量同時(shí)意味著研究人員還必須使用穩(wěn)定的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)區(qū)分有意義的腫瘤信號(hào)、隨機(jī)突變和檢測(cè)誤差。
腫瘤釋放的小東西
除了繼續(xù)數(shù)據(jù)分析工作，研究液體活檢的研究人員還需要仔細(xì)考慮他們的對(duì)照樣品。馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司臨床測(cè)序和腫瘤學(xué)研發(fā)部主任Kelli Bramlett說(shuō)：“很難讓人造樣本表現(xiàn)得像真正的無(wú)細(xì)胞核酸一樣，所以這是一個(gè)相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。”
Bramlett的團(tuán)隊(duì)致力于人類血液中DNA和RNA的液體活檢技術(shù)的研發(fā)。雖然后者因難以分離而聞名，但她解釋說(shuō)，即使是已降解的RNA通常也含有足夠完整的序列用來(lái)進(jìn)行分析，只要研究人員能夠在混雜著其他大量RNA分子的環(huán)境中檢測(cè)到罕見(jiàn)的腫瘤信號(hào)。
極低的信噪比給科學(xué)家和試劑供應(yīng)商帶來(lái)了更多挑戰(zhàn)。Bramlett說(shuō)：“你在干草堆里找這些針，但你經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)很多你并不想找的針，比如產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中的微小變化，或者你選用的對(duì)照樣品的細(xì)微差別。”
大量的質(zhì)量檢測(cè)和多樣化的市場(chǎng)需求使得好的商品化試劑和對(duì)照樣品都異常昂貴。Bramlett解釋說(shuō)，生產(chǎn)商首先是致力于提供包含多種對(duì)照樣品的復(fù)合產(chǎn)品，以滿足盡可能多種類型的液體活檢需求。 而聚焦于少數(shù)腫瘤標(biāo)志物的研究人員則不得不為那些他們并不需要的對(duì)照樣品買單。最近，賽默飛世爾科技公司開(kāi)始開(kāi)發(fā)更具針對(duì)性的復(fù)合產(chǎn)品，希望可以幫助研究人員進(jìn)行性價(jià)比更高的液體活檢。
然而，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，實(shí)驗(yàn)室需要為樣本收集和處理擬定合理的流程。Bramlett說(shuō)：“很多時(shí)候，人們都低估了這些步驟的重要性。在你開(kāi)始研究之前，應(yīng)該把所有這些都考慮進(jìn)去，確保你有一個(gè)好的樣本，可以用于評(píng)估你的液體樣品。”
考慮到處理循環(huán)系統(tǒng)游離DNA和RNA片段的難度，許多研究人員在液體活檢中尋找其他東西進(jìn)行分析也就不足為奇了。這一領(lǐng)域的另外兩個(gè)主要目標(biāo)，即循環(huán)腫瘤細(xì)胞和外泌體，它們也面臨著各自的挑戰(zhàn)。
Michael Kazinski是位于德國(guó)希爾登的凱杰公司（Qiagen）的樣本準(zhǔn)備技術(shù)全球產(chǎn)品管理高級(jí)總監(jiān)兼負(fù)責(zé)人，他說(shuō)：“循環(huán)腫瘤細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于它們是完整的活細(xì)胞。”從這些細(xì)胞中分離出的基因組DNA和RNA使研究人員能夠從液體活檢中獲得完整的轉(zhuǎn)錄譜。這反過(guò)來(lái)又會(huì)幫助我們獲得對(duì)腫瘤生物學(xué)的深入了解，至少在理論上是如此。
但研究人員長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為，腫瘤直到病情較晚時(shí)才會(huì)將完整的細(xì)胞釋放到血液中，而且是以極小的數(shù)量釋放出來(lái)。因此，如果想要成功地完成一項(xiàng)檢測(cè)，需要分離出足夠的此類稀有細(xì)胞，從而對(duì)腫瘤做出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的有效診斷。而這通常是在腫瘤快速生長(zhǎng)和變化的階段。最新的研究表明，這些循環(huán)腫瘤細(xì)胞可能出現(xiàn)得更早，但要找到它們，仍舊需要極其靈敏的檢驗(yàn)方法。
第三種方法，同時(shí)也是最新的液體活檢方法叫做體外篩選，這種方法依賴于循環(huán)的亞細(xì)胞囊泡。Kazinski解釋說(shuō)這些被稱為“外泌體”的小囊泡實(shí)際上是從體內(nèi)的每個(gè)活細(xì)胞中釋放出來(lái)的。 它們具有天然功能，但也可作為RNA的保存容器，除信使RNA外，微泡還含有微小RNA和蛋白質(zhì)，提供有關(guān)其親本細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)環(huán)境的信息。
不管研究人員采用何種方法， Kazinski都再三強(qiáng)調(diào)謹(jǐn)慎處理樣本的重要性，他說(shuō)：“被嚴(yán)重低估的是細(xì)節(jié)問(wèn)題的影響：如何抽血，如何儲(chǔ)存甚至運(yùn)輸它？”凱杰公司推出了一系列經(jīng)過(guò)特殊處理的血液采集系統(tǒng)，可對(duì)化學(xué)特征穩(wěn)定的樣本進(jìn)行靈敏的液體活檢。
隨波逐“流”
對(duì)于研究循環(huán)腫瘤細(xì)胞的人來(lái)說(shuō)，采樣后的下一步是盡可能快速且溫和地分離出所需的細(xì)胞。許多腫瘤細(xì)胞的表面上有獨(dú)特的抗原，而利用親和力技術(shù)可以很容易地將這些細(xì)胞從血液樣品中分離出來(lái)。事實(shí)上，這是在第一個(gè)獲得美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的液體活檢試驗(yàn)CellSearch的基礎(chǔ)上，由強(qiáng)生公司的子公司Veridex開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法。該測(cè)試技術(shù)專利現(xiàn)已由加州圣迭戈的Menarini Silicon生物系統(tǒng)公司掌握。
不幸的是，CellSearch也成為了液體活檢開(kāi)發(fā)人員的一個(gè)警示。2008年，美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)了一項(xiàng)測(cè)定乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌預(yù)后的試驗(yàn)。當(dāng)隨后的研究發(fā)現(xiàn)CellSearch的檢測(cè)對(duì)臨床結(jié)果沒(méi)有什么影響時(shí)，保險(xiǎn)公司就失去了繼續(xù)掏錢的興趣。
盡管許多研究人員仍在開(kāi)發(fā)基于親和力的技術(shù)來(lái)分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞，但也有一些人正在利用正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的物理差異來(lái)進(jìn)行分離研究。加州門羅公園Vortex Biosciences公司的研發(fā)副總裁Elodie Sollier-Christen說(shuō)：“當(dāng)你走在河邊，會(huì)看到河中的漩渦將樹(shù)葉和樹(shù)枝困住，我們用的是完全相同的流動(dòng)現(xiàn)象，只是規(guī)模要小得多。”
渦旋系統(tǒng)利用微流控芯片產(chǎn)生微小的渦旋，從血漿樣本中捕獲體積更大、形變更嚴(yán)重的癌細(xì)胞。芯片本身是一次性的，系統(tǒng)是完全自動(dòng)化的。用戶只需從病人身上采集血液樣本，將其輸入設(shè)備，并在幾個(gè)小時(shí)后取回已經(jīng)純化的腫瘤細(xì)胞即可。Sollier-Christen說(shuō)：“這些細(xì)胞沒(méi)有被束縛或擠壓，所以它們?cè)诹鲃?dòng)過(guò)程中保持完整，然后研究人員可以把循環(huán)腫瘤細(xì)胞拿到他們想要用的各種平臺(tái)上進(jìn)行化驗(yàn)。”雖然渦旋系統(tǒng)是專門為血液設(shè)計(jì)的，但該公司正與學(xué)術(shù)界的研究人員合作，開(kāi)發(fā)出可以將細(xì)胞從其他體液中分離出來(lái)的方法，比如腦脊液和尿液。
除了保持細(xì)胞的完整性，渦旋系統(tǒng)還使得研究人員能分離出它們，并用來(lái)進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序或其他分析。這種深入細(xì)致的對(duì)比分析也說(shuō)明了至少有些腫瘤釋放細(xì)胞的時(shí)間比科學(xué)家們認(rèn)為的要早。Sollier-Christen說(shuō)：“最初的想法是循環(huán)腫瘤細(xì)胞只出現(xiàn)在腫瘤晚期。”但是她指出，在過(guò)去的一年里，那些高靈敏度技術(shù)檢測(cè)到的結(jié)果顯示這些細(xì)胞出現(xiàn)在腫瘤發(fā)展的早期，甚至是在腫瘤可以被常規(guī)成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)之前。
面向未來(lái)
液體活檢研究的最新趨勢(shì)是尋找循環(huán)系統(tǒng)中的細(xì)胞外囊泡，這在一定程度上源于研究人員對(duì)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的失望。印第安納州西拉法葉市普渡大學(xué)的生物化學(xué)教授W. Andy Tao說(shuō)：“我們相信在我們的血液中至少有1萬(wàn)種蛋白質(zhì)。”毫無(wú)疑問(wèn)，腫瘤為其提供了獨(dú)特的蛋白質(zhì)。不幸的是，正常蛋白的高背景，以及循環(huán)磷酸酶和其他降解酶的存在，一直阻礙著研究人員尋找這些罕見(jiàn)的腫瘤生物標(biāo)志物。
為了解決這個(gè)問(wèn)題，Tao博士和他的同事們集中研究了腫瘤釋放出的亞細(xì)胞囊泡。由于大多數(shù)腫瘤在發(fā)展過(guò)程中的某些階段會(huì)表現(xiàn)出磷酸化變化，所以他的實(shí)驗(yàn)室專門研究了囊泡中的蛋白質(zhì)磷酸化。
許多研究者使用免疫學(xué)標(biāo)記從血液中分離細(xì)胞外囊泡，Tao喜歡冗長(zhǎng)但無(wú)偏差的差速離心方法。他的方案是使用逐步提高的離心速度去除血細(xì)胞和細(xì)胞碎片，然后分離出兩種不同大小的囊泡。
下一個(gè)挑戰(zhàn)是鑒定分離出的囊泡中的蛋白質(zhì)，并確定它們的磷酸化狀態(tài)�；诳贵w的測(cè)試也可以達(dá)到這個(gè)目的，但前提是研究人員知道他們正在尋找的蛋白質(zhì)和修飾類型。偏向于更加開(kāi)放式搜索的研究人員們通常會(huì)從患病和健康的病人或動(dòng)物身上提取樣本，而后使用質(zhì)譜法建立細(xì)胞外囊泡相關(guān)蛋白的列表。
盡管最近這些研究顯示新的液體活檢發(fā)展的幾個(gè)途徑很有希望，但是Tao警告說(shuō)，將這些研究結(jié)果向臨床應(yīng)用進(jìn)行轉(zhuǎn)化仍然需要一系列技術(shù)上的重要改進(jìn)。“在探索階段，使用差速離心然后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)是完全沒(méi)問(wèn)題的，但是當(dāng)你去驗(yàn)證和檢驗(yàn)臨床樣品時(shí)，我認(rèn)為這肯定不實(shí)用。”相反，他計(jì)劃縮小有用生物標(biāo)志物的范圍，然后開(kāi)發(fā)基于抗體的臨床檢驗(yàn)方法。
不管他們是在尋找游離的DNA、完整的細(xì)胞還是細(xì)胞外囊泡，研究人員和醫(yī)生都對(duì)這個(gè)領(lǐng)域的前景表示樂(lè)觀。Oxnard預(yù)計(jì)，在未來(lái)5年里，這將成為一種常規(guī)手段，成為每家醫(yī)院都需要為癌癥患者提供的服務(wù)�！�
Alan Dove 是馬薩諸塞州的一位科學(xué)作家和編輯。